称心常识网谷氨酰胺合成酶
胞质谷氨酰胺合成酶对水稻根部代谢和叶绿体发育的影响研究
期刊：plant physiology
发表时间：2020.02
单位：日本筑波大学生命环境科学研究科等
播放
研究背景
2020年2月，日本筑波大学生命环境科学研究科等在Plant Physiology发表了名为“Cytosolic GLUTAMINE SYNTHETASE 1;1 modulates metabolism and chloroplast development in roots”的论文。本研究利用反向遗传学、代谢组和转录组分析，系统性比较了水稻中两种谷氨酰胺合成酶（GS），即OsGS1;1和OsGS1;2对根部中央代谢的影响，发现OsGS1; 1作用吸收的有机氮参与维持水稻根部的代谢稳态和质体发育，而OsGS1; 2主要影响氨基酸稳态，而不影响碳代谢。该研究为水稻氮同化的机制提供了新理解。
水稻中的3个谷氨酰胺合成酶基因（OsGS1; 1，OsGS1; 2和OsGS1; 3）有其独特的表达模式，在芽和根中可检测到OsGS1; 1 的转录本，在根和穗中可检测到OsGS1; 2和OsGS1; 3的转录本。敲除OsGS1; 1和OsGS1; 2后的突变体系，在足够铵的情况下会对枝条的生长和产量产生负面影响，这些发现表明，有一个尚待明确的调控反应网络来解释突变体如何以及为什么能在水稻中实现如此不同和特异性的反应。本研究通过构建突变体系，以多组学的技术手段对OsGS1; 1和OsGS1; 2的功能进行了详细的阐述。
研究思路
代谢组样本：Osgs1; 1和Osgs1; 2基因敲除突变体、突变无效合系、野生型植株的三叶期的叶片、叶鞘和根系；6个生物学重复
转录组样本：Osgs1; 1和Osgs1; 2基因敲除突变体及野生型根系；3个生物学重复
研究结果
1、序列分析—构建系统发育树—OsGS1; 1和OsGS1; 2独立调节
据报道，两个水稻GS1基因（OsGS1; 1和OsGS1; 2）的结构不同。为了表征水稻中的GS基因，本研究构建了水稻，拟南芥，玉米和大豆的代表性GS基因系统进化树，发现水稻，拟南芥，玉米和大豆中的GS基因高度保守，OsGS1; 1与玉米中的GRMZM2G036464（ZmGln5，GS1-4）和GRMZM5G872068（ZmGln4，GS1-3）高度相似，形成一个单一的群体。而OsGS1; 2与GRMZM2G050514（ZmGln6，GS1-1）具有高度相似性。
之后，本研究比较了八聚体序列在OsGS1; 1和OsGS1; 2启动子中的局部分布，发现OsGS1; 1和OsGS1; 2的启动子序列相似度较低。另外，在这些启动子中，假定的调控元件的比对未检测到任何共享元件。这些结果表明这两个基因可能是独立调节的。
2、功能预测—基因网络和GO分析—OsGS1; 1与N、C代谢的基因相关
本研究通过整合不同基因网络预测方法以及寻找与水稻GS1相关的基因，用水稻幼苗和根部样品的公开转录组图谱进行了基因网络分析。在芽数据集中，OsGS1; 1相关的有49个基因对，OsGS1; 2相关的有17个基因对，在根数据集中OsGS1; 1相关的有142个基因对，OsGS1; 2相关的有220个基因对。
进行GO分析以可视化每个基因网络。根数据集的富集分析显示，OsGS1; 1基因网络（130个节点和202个边）中的GO类别之间存在更多的联系。在OsGS1; 1基因网络显著富集的65个GO条目中，胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH1）在氧化戊糖磷酸（OPP）途径中，甘油3-磷酸脱氢酶（GPDH）作为3-磷酸甘油酯穿梭的成分，NADP特异性异柠檬酸脱氢酶（IDH）为TCA循环相关物质。而包含四个转运蛋白基因和三个离子通道/泵基因的离子转运在OsGS1; 2基因网络的14个GO条目中显著富集。总的来说与OsGS1; 1和OsGS1; 2相关的基因之间没有重叠。这些结果表明，与OsGS1; 2基因相比，OsGS1; 1与涉及N和C代谢的基因有更紧密的联系。
3、表型观测—比较野生型和敲除突变体的表型—四叶期之后OsGS1; 1突变体生物量减少
本研究采取反向遗传学方法，使用敲除OsGS1; 1和OsGS1; 2的突变体以确定在铵离子作为唯一N源的情况下这两种GS1酶的功能。如Osgs1; 1和Osgs1; 2突变体植株所表明的，突变体植物在灌浆和成熟阶段表现出形态变化。如Kusano等人先前所述，在存在充足铵盐的情况下，在Osgs1突变体的三叶期没有观察到明显的幼苗表型差异。在四叶期之后，与对照幼苗相比，Osgs1; 1突变体幼苗的地上部分生长量减少了50％，但在Osgs1; 2突变体幼苗中未观察到这种影响（图1）。
图1. A-C图是三叶期到四叶期两种突变体和对照的植株形态，D-G图是四叶期至五叶期突变体和对照的植株形态。NB：野生型，NC：Osgs1; 1突变体，null：Osgs1; 1无效突变植株，ND：两个独立的Osgs1; 1突变体 ,gs1;2：Osgs1; 2突变体
4、代谢组分析—PCA分析和差异物质筛选—碳/氮代谢与Osgs1; 1显著相关，与Osgs1; 2无关
为了研究Osgs1; 1和Osgs1; 2突变体的代谢物组成，采用GC-MS平台对以1.0 mM铵作为唯一N源的水培的两个Osgs1突变体、来自Osgs1突变体的无效合系和WT中的三叶期叶片（LB）和叶鞘（ LS）以及根进行代谢物检测。PCA图显示，样品能够根据对照（野生型和无效系）、突变体以及组织的不同进行区分。在Osgs1; 1突变体的三个组织中，糖和糖磷酸酯的表达水平显着增加（图2），Osgs1; 1突变体根中氨基酸表达增多。相比之下，LB，LS和Osgs1; 2突变体的根中氨基酸和多胺水平的显着降低。
由于Osgs1; 2主要在根中表达，因此研究主要比较Osgs1; 1和Osgs1; 2根代谢物谱的差异。突变体根中Osgs1; 1与Gln和Asn表达水平之间的相关性显著，而Osgs1; 2突变体和对照则没有这种相关性。相对于野生型，Osgs1; 1突变体中的糖水平（如蔗糖和海藻糖）增加（图2，图3）。Osgs1; 2突变体的根中糖含量没有显著变化。为了确定累积的碳水化合物是否用于Osgs1; 1突变体的根中的淀粉合成，对Osgs1; 1和Osgs1; 2突变体以及对照根样品中的淀粉含量进行了定量。淀粉含量仅在Osgs1; 1突变体的根部降低（图3）。这些结果表明，代谢对OsGS1; 1和OsGS1; 2功能的N同化的影响是不同的，OsGS1; 1产生的有机氮对于维持中央代谢中有机N和有机C之间的平衡至关重要。
图2. 突变体和对照植株根系中的差异表达代谢物
图3. Osgs1突变体中的糖和淀粉积累情况
5、基因表达分析—差异基因RT-qPCR和Mapman分析—Osgs1; 1与光合作用相关基因显著相关
为了研究被OsGS1; 1或OsGS1; 2吸收的有机氮的存在是否会影响水稻根系中的转录本丰度，研究对Osgs1-knockout突变体及其对照进行了转录本分析。发现编码PSII、电子载体、细胞色素b6 / f、PSI和叶绿体中ATPase的成分的基因在Osgs1; 1突变体的根中上调，而Osgs1; 2突变体的根中光合作用相关基因的表达水平没有明显变化（图4）。为了验证数据结果进行了RT-qPCR分析，发现编码铁氧还蛋白-NADP还原酶（FNR）、PSI反应中心亚基N（PN）、谷氨酰-tRNA还原酶（HEMA1）、镁-原卟啉IX单甲基酯环化酶（CRD1）和突变体根中的果糖1,6-双磷酸酶（FBPase）相关基因显著上调（图4）。此外还量化了基因OsLhcb1和OsLhcb2的mRNA丰度，这些基因编码叶绿体中光系统II的光捕获复合体的蛋白质，并且发现相对于对照，两个突变体中该基因的转录丰度也都增加了。为了研究外源Suc的添加是否影响光合作用相关基因的表达水平，进行了光合作用相关基因的RT-qPCR分析。发现Suc处理后，除了HEMA1和CRD其余基因的转录水平没有显著变化。
Osgs1; 1突变体还显示出在三叶期的光合作用相关基因的转录丰度显著增加，然而，目前尚不清楚在四叶期是否观察到光合作用相关基因的这种上调。为了深入了解此现象，在三叶期和四叶期对Osgs1; 1突变体的根进行了转录本分析。与光合作用相关的基因在三叶期被上调，而在四叶期没有上调。
图4. A图：Osgs1; 1和Osgs1; 2突变体中与光合作用相关基因的Mapman可视化图；B图：在Osgs1; 1和Osgs1; 2突变体根系样品中与光合作用相关基因的表达水平
图5. 在三至四叶期，通过RT-PCR对Osgs1;1 vs WT中与光合作用相关的差异基因进行定量的结果
6、多组学联合分析—KEGG共注释—OsGS1; 1和碳/氮代谢、光合作用相关
Osgs1; 1突变体的代谢产物和转录谱分析发现了糖和氨基酸的异常积累以及光合作用相关基因的上调（图2，图3，图4）。基因集富集分析（GSEA）的结果表明，与对照相比，突变体的上调基因显著富集于光合作用及相关条目。该发现与MapMan可视化的结果一致。MSEA揭示了代谢物变化主要与N相关的代谢条目，包括“尿素循环”，“氨循环”和“谷氨酸代谢”。
为了可视化OsGS1; 1的功能丧失对水稻根部中央代谢的影响，研究使用GAM（“基因和代谢物”）分析方法，整合代谢组和转录组来进行分析。对Osgs1; 1的GAM分析突出显示了四个特定的代谢模块，作为KEGG途径中的子网络（图6）。在模块1（M1）中，积累了蔗糖、6-磷酸海藻糖和海藻糖，而与对照组相比，编码与糖和淀粉代谢相关的酶的基因显示出明显的下调。M2包含涉及天冬氨酸和TCA循环的子网络。相比之下，M3中属于Calvin-Benson循环的基因有明显的上调。M4突出了色氨酸的产生，这是由于使用丝氨酸和吲哚-3-甘油磷酸酯作底物进行酶促转化的结果。
图6. 水稻根部Osgs1;1代谢调控网络的GAM可视化图
7、生理表型观测—显微电镜观察叶绿体发育—Osgs1; 1与叶绿体发育相关
由于光合作用相关基因的上调，本研究对Osgs1; 1突变体，Osgs1; 2突变体，Osgs1; 2互补系和WT植物的根进行了透射电子显微镜（TEM）观察分析，在Osgs1; 1突变根的成熟区（MZ）V的横截面中，研究了三个区域，分别由组织，即表皮，外表皮和厚壁组织（Epi/Exo/Scl），含有气孔的皮层（cortex），内胚层，中柱鞘和中柱（Endo/Per/Stele）（图7）。在Osgs1; 1突变体中，皮质中存在发达的叶绿体，其中含有类囊体膜和颗粒堆积物，而在MZ V区的根的Endo / Per / Stele区中却不存在（图7）。在MZ III处，Osgs1; 1的突变体的皮层区域也观察到了这种成熟的叶绿体的发育。在Osgs1; 2突变体，Osgs1; 2互补系或WT的根部未观察到叶绿体发育（图7）。
为了确定Osgs1; 1根中叶绿体是否进行了光合作用，本研究使用高性能脉冲幅度调制叶绿素荧光计（PAM）分析了叶绿素荧光（图7）。在Osgs1; 1突变体的根中，光化学光照下PSII（ΦII）的有效量子产率显着高于Osgs1; 2突变体和相应对照的根（图7）。Osgs1; 1突变体根部的ΦII水平和叶绿素荧光的光化学猝灭（Qp）高于光照条件下对照的根部，而非光化学猝灭的量子产率[Φ（NPQ）]在Osgs1; 1突变根中比在其他基因型的根中更低。这些观察结果表明，在Osgs1; 1-突变根中，PSII相对于光化学反应具有活性，并且PSII产生的还原力通过电子传输链传输，用于光合暗反应。当WT根在无光的水培培养条件下生长时，未观察到F v / F m。这些结果表明，Osgs1; 1突变根中检测到的光合作用参数是根部暴露于弱光下的特异性反应。
图7. A图：组织的透射电子显微镜观察结果；B图：在OsGS1; 1 突变体根系中叶绿体发育和脉冲幅度调制叶绿素Ⅱ荧光分析
迈维小结
研究目的：通过研究两种谷氨酰胺合成酶基因（Osgs1; 1和Osgs1; 2）的功能揭示水稻氮的同化机制。
研究结果：Osgs1; 1主要参与维持水稻中的碳氮代谢平衡，促进生物量积累，且与质体发育相关。Osgs1; 2主要与氨基酸稳态相关，不参与碳代谢。
点石成金：本研究作者主要关注初级代谢，且代谢组的检测平台为GC-MS，共采集到225个峰，鉴定了82个物质，实际上植物里还有很多次生物质与N有关，比如生物碱。另外，LC-MS/MS平台相对于GC-MS的灵敏度更高、检测的物质范围更广，所以鉴定到的物质会更多，更有利于研究。
往期精彩：
网红杰青 | 罗杰教授网络视频直播全网开启！
大咖来啦 | 教授云集，线上开讲，都有谁！
【限时免费】| 杰青基金申请指导&组学研究宝典
客户文章 | PBJ 揭示植物激素与种子活力的那些故事
