流式细胞仪原理(什么是流式细胞仪？)

流式细胞仪原理
在实验室环境中分析细胞时，流式细胞仪是一种广泛使用且全面的单细胞分析方法。本文概述了什么是流式细胞仪，其工作原理，存在的不同类型，如何分析数据以及流式细胞仪未来的前景。

什么是流式细胞仪？流式细胞技术是一种用于分析细胞的具有多种应用的技术，包括细胞计数、表型分析、细胞周期评估和生存力检测等不同应用。流式细胞仪中激光产生的光被样品中的细胞散射，由检测器测量，然后转换为可以分析和测量的信号。

流式细胞仪如何工作？开始使用流式细胞仪，第一步是准备要分析的样品。从细胞培养物，血液或分解的组织中获得的细胞应制成悬浮液。将该细胞悬浮液分成数个试管进行染色，保留未染色细胞作为对照。通过添加标记有荧光探针的抗体或染色细胞成分的染料对其他细胞样品染色。分析细胞内蛋白质时，首先必须将细胞固定（使用福尔马林缓冲液）并进行透化（使用透化剂），以使抗体和染料进入细胞。细胞与抗体或染料孵育后，将细胞在缓冲液中洗涤，然后重悬在基于盐的缓冲液中进行分析。然后将准备好的样品引入流式细胞仪。

流式细胞仪有三个主要组成部分：液流系统，光学系统和电子系统。在流式细胞仪的中心部分-流通池-样品材料遇到激发光并散射光，随后该光被检测系统读取和记录，如下图1。

图1：流式细胞仪主要组件。1.射流系统包含鞘液（一种基于盐的缓冲液或水），该鞘液被加压通过机器，以引导细胞样品通过激光，以便对每个单个细胞进行单独测量。2.光学器件由向样品发射光的激光器和收集光学器件（例如光电倍增管（PMT））组成，该光电倍增管（PMT）收集样品散射的信号。3.最后，细胞仪的电子设备将检测到的信号转换为可以使用软件进行分析的数字参数。

什么是前向散射，侧向散射和荧光信号？流式细胞仪的三个主要输出测量值是前向散射，侧向散射和荧光信号。激光的可见光会反射出每个流通池，从而提供流通的尺寸和形状特征。如下图2：前向散射的前向散射（FSC）是从正方向来的散射而反射细胞的大小。沿着激光路径测量散射，每个单元将使光围绕单元的侧面弯曲，从而引起衍射。因此，FSC的强度反映了细胞的直径。

图2.前向散射

如下图3：侧面散射。 该侧向散射（SSC）是在90度激光束下测量的散射，反映了细胞的粒度或复杂性。细胞中的结构将改变进入细胞的光波的方向，从而导致特定的细胞结构（例如颗粒和细胞核）折射光。SSC越强，折射越大，则预期单元中的粒度就越大。

图3.侧面散射

如下图4：荧光信号。 第三个输出量度是荧光信号。这是激光激发荧光团时发出的光。荧光团是在激发时可以吸收并重新发射光的分子。来自激光源的光子被荧光团的电子吸收，将其移动到更高的能量状态。这些电子然后以光子的形式释放能量以返回其基态。这些光子的波长受过程中分子相互作用损失的能量数量影响。每个荧光团具有其自己的发射光谱，该发射光谱可以与其他荧光团的发射光谱部分重叠。荧光团可以用于标记抗体，这些抗体又可以结合并因此检测细胞上或细胞内的特定抗原，或者可以用作染料直接染色细胞，例如通过与DNA结合。

图4.荧光信号

流式细胞包含哪些仪器？流式细胞仪至少应包含一个激光器，一个检测器和一个流控系统，以确保细胞快速流过激光束。多年来，流式细胞仪中的激光器数量以及检测器的数量和质量已显着增加。这些发展扩大了可以立即检测到的标记的数量。

流式细胞仪可以设计用于特定目的。例如，为了允许高通量的样品，可以并入孔板装载器以实现多个样品的快速手动分析。

流式细胞仪的发展为了增加多参数分析并允许进行更深入的评估，还开发了其他类型的流式细胞仪：

细胞计数仪：Mass cytometry （飞行时间质谱或cyTOF）：该技术使用标记有重金属离子标签的抗体代替荧光团标记抗体。提供超过100种具有有限信号重叠的金属探针，与传统的流式细胞仪相比，可以进行更多的高维分析。因此，可以使用这种技术进行深入的表型分析，在免疫学和癌症等研究领域很有用。与传统流式细胞仪的主要区别在于，包含待分析细胞的液滴在流室内被蒸发，雾化和离子化，质谱仪检测产生的离子。从样品到检测器的离子的飞行时间用于分析。

光谱流式细胞仪：这种流式细胞仪不是评估每个荧光团的峰值发射，而是使用一系列检测器来测量每个荧光团的整个光谱。然后使用算法将这些光谱分离。这允许使用具有重叠光谱的荧光团来增加一个实验中分析的参数数量。 

成像细胞技术：这种类型的流式细胞技术结合了传统的流式细胞术和荧光显微镜。该技术还允许评估细胞的形态，并可用于可视化蛋白质的共表达，细胞结合，蛋白质的核易位和免疫细胞突触。 

细胞分选：荧光激活细胞分选仪（FACS）是一种使用流式细胞仪对细胞进行分选以进行进一步分析或实验的设备。不仅可以测量细胞特征，还可以根据特定特征选择细胞，并将其导入收集容器中以纯化某些细胞类型的样品。使用FACS的一个例子是从血液中的外周血单核细胞（PBMC）样本中获得T细胞。由于分选后通常需要进一步培养细胞，因此必须在无菌条件下进行分选，并且操作过程要轻柔以避免损坏细胞以降低其生存能力，这一点至关重要。因此，由于要分析的细胞被破坏，因此无法在质谱中进行细胞分选。分选器可以是传统的基于流式细胞仪的或基于光谱的。 
对特定参数为阳性或阴性的细胞群体进行分类。使用单细胞样品液流的高频振荡来分离细胞，以产生带正电荷或负电荷的液滴。然后根据液滴的电荷将其引导至收集容器。

如何分析流式细胞仪数据？从收集的流式细胞仪数据创建直方图和点图以进行分析。但是首先，应采取几个处理步骤以进行准确的分析。

选择可行的单细胞通常，分析将从基于某些特征的目标单细胞选择开始，这是通过称为门控的过程完成的。分析软件允许用户在某些细胞群体周围绘制线（称为门）以选择它们进行进一步分析。对单个细胞进行门控是必不可少的，因为双峰，同时通过激光的细胞可能会导致其中一个细胞产生假阳性信号。使用显示FSC和SSC数据的点图，选择具有目标群体的大小和粒度的单个细胞进行进一步分析。

此外，至关重要的是要提高细胞生存力，因为死细胞倾向于发出更多的自发荧光，这可能会影响分析。自体荧光可能与使用的某些荧光团重叠，从而导致假阳性信号。使用活力染料评估活力，活力染料可以与DNA结合或与细胞上和细胞内的游离胺基反应。

补偿
下一步分析是评估每个细胞测量的特定荧光信号。由于可用荧光团的发射光谱中存在重叠，因此使用多个荧光团进行的实验可能需要补偿。重叠的光谱可能会导致假阳性，因为测得的信号来自另一个荧光团。因此，适当的实验设计对于构建具有最小光谱重叠的荧光团面板至关重要。即使这样，也经常需要校正重叠或补偿。可以使用阳性和阴性对照样品调节补偿，理想情况下使用研究的细胞类型进行补偿，或者在不可能的情况下使用补偿珠进行调节。可以在测量期间或之后的分析中设置补偿。

区阈(region,R)与门(gate,G)分析一旦设置了补偿，就可以通过从每个荧光检测通道收集数据来分析每个标记。可以对目标群体执行其他门控，以关注特定参数的存在或不存在。密度图和直方图均可用于此目的，如下图5。

图5：密度图和直方图。 

密度图将单个细胞显示为根据其荧光特性分布的点。颜色用于指示具有这些特征的分析中的细胞数。可以一次显示两个标记，一个在X轴上，一个在Y轴上，根据这两个参数的表达区分细胞。直方图显示单个参数，并在Y轴上显示细胞计数，在X轴上显示荧光强度。

控件对于适当的门控必不可少，可以根据阳性和阴性控件进行设置。阳性对照是表达具有目标荧光团的抗体检测到的标记的细胞样品。阴性对照可以是未染色的细胞或用同型对照染色的细胞。用分析中使用的荧光团标记的抗体，其针对细胞上不存在的抗原，以校正非特异性背景。对于具有许多参数的较大面板，建议使用荧光减一（Fluorescence minus one，FMO）控件。这些控件包括单个流量面板的所有荧光标记减去一个，应为实验中使用的每种荧光标记创建一个。它允许从重叠的光谱轮廓中检测背景信号。

高维数据分析研究参数数量的扩展改变了流式细胞仪数据分析的方式。添加每个参数后，数据将获得更多维度。因此，已经开发了新的分析技术来从这些高维数据中提取信息。包括主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），密度归一化事件的生成树进度分析（SPADE）和t随机近邻嵌入（Stochastic Neighbor Embedding,tSNE）算法。这些算法基于表型的相似性和单元格之间的差异对数据进行聚类，以进行二维分析。 

流式细胞仪有哪些应用？流式细胞仪可用于细胞生物学和很多临床应用。
细胞生物学的应用包括：
细胞计数
细胞周期分析
测量细胞生存力
增殖
各种细胞类型的表型鉴定和随后的细胞分选

对于（临床前）生物学应用，流式细胞仪可用于：
检测各种免疫细胞
评估免疫细胞激活后细胞因子的产生及其对靶细胞的潜在反应性
深入研究癌细胞和肿瘤微环境中的细胞
检测被病毒感染的细胞
在生育力分析中评估精子的特征
监测心脏病和败血症
在神经科学研究中表征细胞

流式细胞仪的挑战和局限性尽管流式细胞术可以为细胞生物学和临床应用提供优势，但该技术仍存在一些缺点。系统中的流体很难保持一致，因为细胞或碎屑会导致阻塞或影响分析的流速发生变化。当分析较大的细胞（例如癌细胞）时，存在特别的风险。管道中的污染会导致系统阻塞并中断流量。激光对准对于确保一致的结果也是必不可少的，应定期检查。其他限制包括细胞计数仪对细胞造成损害，在分选细胞时影响分析和后续培养的潜力，以及无法通过单细胞分析来提供有关组织特征的信息。

流式细胞术的未来发展在过去的几十年中，该领域的主要发展使得可以在每个样本中研究的参数数量显着增加，并且减小了这些笨重机器的尺寸。这些发展可能会在未来几年继续，只会增加获得数据的复杂性，并且需要开发软件来标准化和验证此类分析。

该领域的进一步发展将允许在更广泛的规模上进行更广泛的分析，增加可以为每个样本分析的标记物的数量，并可以采用先进的数据分析方法来对大样本量进行详细分析。减小仪器的尺寸将使其更容易放置在实验室的台式机上，甚至可以在现场以有限的格式使用。此外，工作流程的更多标准化将降低用户错误率，并允许高通量临床和诊断应用程序。自动移液，设置补偿并允许自动分析孔板可以提高流式细胞仪分析的可靠性。

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